Lungengewebeschnitte in der wehrmedizinischen Toxikologie:
Vom „Lungengummibärchen“ zum hochfunktionellen Präzisionslungenschnitt

Lung Tissue Sections in Military Medical Toxicology: from “Lung Gummy Bears” to Highly Functional ­Precision-Cut Lung Slices

Fee Gölitz ^a,b, Julia Herbert^c, Franz Worek^a, Timo Wille^a

^aInstitut für Pharmakologie and Toxikologie der Bundeswehr, München

^b Walther-Straub-Institute für Pharmakologie and Toxikologie, Ludwig-Maximilians-Universtät, München

^c Department of Pharmacology and Toxicology, Ernest Mario School of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ, USA

Zusammenfassung

Expositionen mit Organophosphat-Nervenkampfstoffen (OP-NK) sind eine reale Gefahr für Soldaten und Soldatinnen sowie die Zivilbevölkerung. OP-NK hemmen die Acetylcholinesterase (AChE) und führen zu einem Acetylcholin (ACh)-Überschuss. Dies kann eine cholinerge Krise mit Bronchokonstriktion und Atemnot auslösen und bis zum Tod führen. Trotz der seit Jahrzehnten bestehenden Behandlungsmöglichkeit durch eine Triple-Therapie bestehend aus Oximen, Atropin und Benzodiazepinen bleibt insbesondere die Wirksamkeit der AChE-Reaktivatoren begrenzt. Um neue therapeutische Ansätze zu erforschen, wurden Präzisionslungenschnitte (Precision-Cut Lung Slices, PCLS) als Modell eingesetzt, welche Experimente auf molekularer und funktioneller Ebene erlauben.

In dieser Arbeit wurde erstmals die AChE-Aktivität in intaktem Lungengewebe mittels eines enzymatischen, kolorimetrischen Assay (modifizierter Ellman-Assay) bestimmt. Zudem wurden die Auswirkungen von OP-NK und AChE-Reaktivatoren auf die Atemwege mittels Videomikroskopie untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine starke Korrelation zwischen der Wiederherstellung der AChE-Aktivität und der funktionellen Verbesserung der Atemwege. Dies macht PCLS zu einem vielversprechenden Modell, mit dessen Hilfe neue, wirksamere Reaktivatoren entwickelt werden können, außerdem kann die Verwendung von PCLS Tierversuche reduzieren.

Schlüsselwörter: Organophosphat-Nervenkampfstoffe, Acetylcholinesterase, Präzisionslungenschnitte, Oxime, Ellman-Assay

Summary

Exposure to organophosphate nerve agents (OPNA) poses a danger to soldiers and civilians. OPNA inhibit acetylcholinesterase (AChE), leading to bronchoconstriction, respiratory distress, a cholinergic crisis, and even death due to the resulting acetylcholine (ACh) overflow. Despite the treatment option of triple therapy with oximes, atropine, and benzodiazepines, which have been available for decades, the efficacy of AChE reactivators remains limited. Precision-cut lung slices (PCLS) were used to explore new therapeutic approaches as a model that allows experiments at the molecular and functional levels [4].

In this study, AChE activity in intact lung tissue was determined for the first time using an enzymatic, colorimetric assay (modified Ellman assay). In addition, the effects of OPNA and AChE reactivators on the airways were investigated using video microscopy. The results show a strong correlation between the restoration of AChE activity and the functional improvement of the airways. This makes PCLS a promising model for the development of new, effective reactivators and leads to a reduction of animal testing.

Keywords: organophosphate nerve agents; acetylcholinesterase; precision-cut lung slices; oxime; Ellam-assay

Einleitung

Organophosphat-Nervenkampfstoffe (OP-NK) sind eine erhebliche Bedrohung für die Gesundheit und Sicherheit von Soldaten und Soldatinnen sowie der Zivilbevölkerung – Giftgas-Attacken und Anschläge der letzten Jahre in Syrien, Großbritannien und Russland unterstreichen dies [2][9][11]. Die toxische Wirkung der OP-NK beruht auf der Hemmung der AChE, was zu einem Überschuss an Acetylcholin (ACh) führt [1][6]. Eine daraus resultierende cholinerge Krise kann unbehandelt tödlich verlaufen [5]. Die Behandlung erfolgt derzeit mit einer Kombination aus Oximen (AChE-Reaktivatoren), Atropin (muskarinerger Antagonist) und Diazepam (antikonvulsives Benzodiazepin) [7]. Diese Triple-Therapie ist jedoch nicht für alle OP-NK ausreichend wirksam. Vor allem die verwendeten AChE-Reaktivatoren sind nicht immer effektiv genug (Spektrum der OP-NK und Geschwindigkeit der Reaktivierung). Ferner gibt es immer neue OP-NK, die zum Teil auch mit Hilfe künstlicher Intelligenz entwickelt werden [10]. Dies zwingt die therapeutische Forschung, neue effektivere Breitspektrum-AChE-Reaktivatoren zu entwickeln. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, sind innovative Lungen-Testmodelle erforderlich. PCLS bieten als ex vivo-Modell eine vielversprechende Möglichkeit, potenzielle Reaktivatoren effizient und ethisch vertretbar zu untersuchen (Abbildung 1).

Abb. 1: Schematischer Überblick in 5 Stufen: Die Stufen 1–4 reichen von der Ratte zum Präzisionslungenschnitt (Precision-Cut Lung Slice, PCLS). Ab Stufe 5 können sowohl die AChE-Aktivität als auch die Atemwegsfunktionalität bestimmt werden. (Diese Abbildung wurde mit BioRender erstellt.)

Methodik

PCLS-Präparation

Nach der Entnahme der Rattenlunge wird diese über die Trachea mit einer Agarose-Lösung befüllt und anschließend gekühlt gelagert, sodass die Agarose aushärtet. Aus der Lunge werden anschließend Stanzen mit einem Durchmesser von 8 mm präpariert. Diese werden mit einem Krumdieck-Tissue-Slicer in 250 µm dünne PCLS geschnitten, die nach mehreren Wasch- und Inkubationsschritten am Folgetag für Experimente bereit sind. Aus einer Rattenlunge können dabei bis zu 200 PCLS gewonnen werden.

Bestimmung der AChE-Aktivität

Ein modifizierter Ellman-Assay wurde erstmals eingesetzt, um die AChE-Aktivität in intaktem Gewebe zu bestimmen [3][13]. Je 4 PCLS pro Messung wurden erst verschiedenen OP-NK (Sarin, Cyclosarin und VX; je 1 µM) ausgesetzt und dann mit 3 Reaktivatoren behandelt: den Oximen Obidoxim und HI-6 (je 30 µM) sowie dem experimentellen Nicht-Oxim NOX-6 (100 µM). Es erfolgten sowohl kontinuierliche als auch diskontinuierliche Messungen, um die AChE-Aktivität nach den verschiedenen Behandlungen zu bestimmen. Die Farbumschläge wurden photometrisch bei 37°C und 436 nm Wellenlänge über mehr als 30 min quantifiziert, um so die AChE-Aktivität zu messen. Je stärker der Farbumschlag war, desto höher war auch die AChE-Aktivität.

Funktionelle Analyse der Atemwege

Die Auswirkungen von Sarin und Cyclosarin (je 1 µM) sowie der anschließenden Behandlung mit Obidoxim (30 µM) auf die Atemwegsbereiche wurden mittels ­Videomikroskopie dokumentiert und quantifiziert. Die Messbedingungen wurden analog zu denen der AChE-Aktivitätsbestimmungen gewählt. Änderungen der Atemwegsfläche vor und nach der Exposition sowie nach der Behandlung wurden über mehr als 30 min gemessen und miteinander verglichen.

Ergebnisse

Molekulare Ebene: AChE-Aktivität

Die AChE-Aktivität wurde durch die OP-NK-Exposition stark gehemmt (≤12 ± 2 %). Die Reaktivierung variierte je nach OP-NK und Reaktivator:

• Sarin (GB): Obidoxim 83,0 ± 6,5 %, HI-6 64,4 ± 0,7 %
• VX: Obidoxim 70,7 ± 2,5 %, NOX-6 53,3 ± 3,7 %, HI-6 50,7 ± 1,2 %
• Cyclosarin (GF): Obidoxim 12,0 ± 2,4 %, HI-6 15,4 ± 2,7 %

Die Ergebnisse stehen im Einklang mit bereits veröffentlichten Daten zu isolierter AChE [12]. Dies unterstreicht die Vertrauenswürdigkeit von PCLS als neue Plattform für das Screening von Reaktivatoren.

Funktionelle Ebene: Atemwegsveränderungen

Videomikroskopie-Untersuchungen zeigten nach Exposition der PCLS mit Sarin und Cyclosarin signifikante Verengungen der Atemwege (≤ 13 ± 4 %). Nach Obidoxim-Behandlung öffneten sich die Atemwege, und zwar unterschiedlich stark, je nach OP-NK-Exposition. Beispielsweise wurden Sarin-exponierte Atemwege durch Obidoxim deutlich erweitert (73.6 ± 6.5 %), während Cyclosarin-exponierte Atemwege sich nicht regenerierten.

Korrelation zwischen molekularer und funktioneller Ebene

Die Vergleiche der über 30 min gemessenen Ergebnisse auf molekularer (AChE-Aktivität) und funktioneller (Veränderung der Atemwegsflächen) Ebene wiesen eine starke Korrelation auf, was die Aussagekraft des Modells unterstreicht.

Steigung % der prozentualen AChE-Aktivität:

• Sarin (GB)/Obidoxim (OBI) = 2,8
• Cyclosarin (GF)/Obidoxim (OBI) = 0,3

Steigung % der ursprünglichen Atemwegsfläche:

• Sarin (GB)/Obidoxim (OBI) = 1,9
• Cyclosarin (GF)/Obidoxim (OBI) = 0

Diskussion

Die Ergebnisse zeigen, dass PCLS ein robustes und vielseitiges Modell für die Untersuchung von AChE-Reaktivatoren sind. Der Einsatz von PCLS ermöglicht eine präzisere Untersuchung sowohl auf molekularer als auch auf funktioneller Ebene und reduziert die Anzahl an Tierversuchen. Die Daten bestätigen die Robustheit des Systems. PCLS bieten die Möglichkeit, neue Reaktivatoren effektiv und zuverlässig zu evaluieren. In Zukunft sollte die Nutzung von humanen PCLS (hPCLS) erwogen werden, um zu evaluieren, ob es speziesbezogene Unterschiede gibt; mit hPCLS ließe sich die Anzahl der Tierversuche noch weiter reduzieren.

Fazit

Präzisionslungengewebeschnitte sind ein vielversprechendes Lungen-Modell zur Untersuchung von AChE-Reaktivatoren und tragen zur Reduktion von Tierversuchen bei. Eine besondere Rolle spielt hier das 3R-Prinzip (Reduction, Refinement, Replacement) [8]. Die beobachtete Korrelation zwischen der AChE-Aktivität und der Reaktion der Atemwege legt nahe, dass neben muskarinergen Antagonisten auch Reaktivatoren eine potenzielle Rolle bei der Behandlung der lebensbedrohlichen Atemwegsverengung infolge von OP-NK-Expositionen spielen könnten.

Finanzierung und Förderung

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GRK 2338, Targets in Toxicology); Projekt P02 (an T.W. und F.W.); F.G. erhielt ein Promotionsstipendium im GRK 2338.

Literatur

1. Costanzi S, Machado J-H, Mitchell M: Nerve Agents: What They Are, How They Work, How to Counter Them. ACS Chem Neurosci 2018; 9(5): 873–885. mehr lesen
2. Dolgin E: Syrian gas attack reinforces need for better anti-sarin drugs. Nat Med 2013; 19(10): 1194–1195. mehr lesen
3. Ellman GL, Courtney K. D., Andres V., et al: A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 1961; 7: 88–95. mehr lesen
4. Gölitz F, Herbert J, Worek F, et al: AChE reactivation in precision-cut lung slices following organophosphorus compound poisoning. Toxicol Lett 2024; 392:75–83. mehr lesen
5. Grob D: The manifestations and treatment of poisoning due to nerve gas and other organic phosphate anticholinesterase compounds. AMA Arch Intern Med 1956; (98): 221–39. mehr lesen
6. Holmstedt B: Pharmacology of organophosphorus cholinesterase inhibitors. Pharmacol Rev 1959; 11: 567–688 mehr lesen
7. Newmark J: Therapy for nerve agent poisoning. Arch Neurol 2004; 61(5): 649–52. mehr lesen
8. Russell WMS, Burch RL: The principles of humane experimental technique. Med J Australia 1960; 1(13): 500-500. mehr lesen
9. Steindl D, Boehmerle W, Körner R, et al.: Novichok nerve agent poisoning. Lancet 2021; 397(10270): 249–252. mehr lesen
10. Urbina F, Lentzos F, Invernizzi C, et al.: Dual use of artificial intelligence-powered drug discovery. Nat Mach Intell 2022; 4(3): 189–191. mehr lesen
11. Vale JA, Marrs TC, Maynard RL: Novichok: a murderous nerve agent attack in the UK. Clin Toxicol (Phila) 2018; 56(11): 1093–1097. mehr lesen
12. Worek F, Reiter G, Eyer P, et al.: Reactivation kinetics of acetylcholinesterase from different species inhibited by highly toxic organophosphates. Arch Toxicol 2002; 76(9): 523–529. mehr lesen
13. Worek F, Eyer P, Thiermann H: Determination of acetylcholinesterase activity by the Ellman assay: a versatile tool for in vitro research on medical countermeasures against organophosphate poisoning. Drug Test Anal 2012; 4(3-4): 282–291. mehr lesen

Manuskriptdaten

Zitierweise

Gölitz F, Herbert J, Worek F, Wille T: Lungengewebeschnitte in der Wehrmedizinischen Toxikologie: Vom „Lungengummibärchen“ zum hochfunktionellen Präzisionslungenschnitt. WMM 2025; 69(1–2): 13-15.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-389

Für die Verfasser

Oberstarzt Prof. Timo Wille

Sanitätsakademie der Bundeswehr

Abteilung Medizinischer ABC-Schutz

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: timowille@bundeswehr.org

Manuscript Data

Citation

Gölitz F, Herbert J, Worek F, Wille T: [Lung Tissue Sections in Military Medical Toxicology: from “Lung Gummy Bears” to Highly Functional Precision-Cut Lung Slices] WMM 2025; 69(1–2): 13-15.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-389

For the Authors

Colonel (MC) Prof. Dr. Timo Wille, MD

Bundeswehr Medical Academy

Department for Medical NBC Protection

Neuherbergstr. 11, D-80937 München

E-Mail: timowille@bundeswehr.org